RESUMO
Leptospirosis is a global zoonosis caused by pathogenic bacteria of the genus Leptospira. The application of the CRISPR/Cas9 system has facilitated the generation of mutants and subsequent evaluation of phenotypes. Since DNA breaks induced by RNA-guided Cas9 nuclease are lethal to Leptospira, different methodologies were implemented to overcome this limitation. Initially, CRISPR interference (CRISPRi) was employed to create knockdown mutants, utilizing a catalytically inactive Cas9 (dCas9). Subsequently, the co-expression of CRISPR/Cas9 and a DNA repair system from Mycobacterium smegmatis enabled the generation of scarless knockout mutants. We eliminated plasmids from the lipL32 knockout L. interrogans strain and further achieved multiple gene mutations via gene silencing in this knockout background. Strains lacking both LipL41 and LipL32 and LigA, LigB, and LipL32, were evaluated. The absence of proteins LipL32 and LipL41 had no effect on leptospiral virulence. On the other hand, mutants lacking LigA, LigB, and LipL32 were unable to cause acute disease. The expanded apparatus for genetic manipulation of pathogenic leptospires via the CRISPR/Cas9 system has allowed the evaluation of multiple mutations upon leptospiral virulence. This work shows that LipL32 and LipL41 are not required for acute disease and consolidates LigA and LigB proteins as virulence factors.
RESUMO
Espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira são o agente causador da leptospirose, uma doença zoonótica amplamente disseminada que afeta humanos e animais. Leptospiras patogênicas colonizam os túbulos renais de uma ampla variedade de animais selvagens e domésticos, os quais excretam as bactérias vivas, via urina, no ambiente. O homem é o hospedeiro acidental e terminal da doença, e após a infecção pode apresentar um quadro variado de manifestações clínicas. Atualmente, estima-se que anualmente cerca de 1 milhão de pessoas são acometidas pela leptospirose em todo o mundo, o que resulta em aproximadamente 60 mil mortes. O entendimento da interação patógeno-hospedeiro, bem como da resposta imune contra proteínas de Leptospira spp., é um passo fundamental para o desenvolvimento de vacinas contra a leptospirose. As proteínas presentes na membrana externa das leptospiras são alvos interessantes de estudo, pois devido a sua localização podem interagir diretamente com o hospedeiro. Resultados prévios indicam que as proteínas Leptospiral Immunoglobulin-like A e B (LigA e LigB) são candidatos vacinais interessantes; ambas proteínas apresentam uma região N-terminal bastante conservada, o que pode ser aproveitada para a geração de anticorpos que possam reconhecer concomitantemente LigA e LigB. Assim, o presente estudo tem como objetivo clonar, expressar e purificar uma sequência que corresponde a porção conservada das proteínas LigA/LigB de L. interrogans sorovar Copenhageni e avaliar suas propriedades imunogênicas. A porção conservada do gene LIC10465 (ligA) foi amplificada por PCR, clonada no vetor pAE e a proteína recombinante expressa em diferentes linhagens de E. coli. A purificação da proteína recombinante foi realizada por cromatografia de afinidade ao níquel. A proteína recombinante produzida foi detectada por Western Blotting e ELISA a partir de incubação com anticorpos monloclonais anti-his, soro hiperimune produzido em animais BALB/c e soros positivos para a leptospirose. A obtenção e validação imunológica dessa proteína, na sua forma recombinante contribuirá significativamente para o avanço dos estudos relacionados à patogenicidade das leptospiras.
